TECHNICKÁ POZNÁMKA # 2/2012:

Obecný popis analýzy dat z aCGH experimentů na platformě Nimblegen a Agilent v servisní laboratoři KRD s.r.o.

 

  • Všechny uvedené obrázky jsou pouze ilustrační.

 

Primární analýza

  • Základní analýzu, která se provádí pomocí softwaru dodávaného výrobcem mikroerejí, od nás obdržíte zdarma v ceně zpracování a hybridizace vzorků aCGH a obsahuje pouze následující kroky:

 

        1. Normalizace uvnitř každé dvoubarevné mikroereje.
 
        2. Výsledky segmentace bez průměrování (jednotkou analýzy jsou jednotlivé sondy) a s průměrováním (obvykle po 100kB pohyblivých oknech, počet sond zahrnutých v jednom průměrovacím okně závisí na denzitě zvolené mikroereje) a výsledky statistické analýzy identifikující významné změny. Výstupem jsou soubory ve formátech GFF, TXT a PDF, které lze prohlížet v tabulkových procesorech a programu SignalMap. Obsahují mimojiné tabulku s kótami významných oblastí.
 
        3. Bez provedení normalizace mezi mikroerejemi není korektní vzájemně porovnávat výsledky mezi dvoubarevnými mikroerejemi, tedy dělat jakékoliv populační závěry. Výsledky připravené výše uvedeným způsobem lze pouze použít pro identifikaci změn, ke kterým došlo na úrovni párového vzorku, tedy například identifikovat změny mezi zdravou a nemocnou tkání jednoho pacienta.
 

Shrnutí typického postupu sekundární analýzy

  • Níže uvedený postup je samostatně placenou nadstavbou k výsledkům základní analýzy, je příkladem sekundární sofistikovanější populační (epidemiologické) analýzy. Může se jednat například o 20 párových vzorků od 20 pacientů, párovým vzorkem může být například biopsie tumoru a biopsie sousedící zdravé tkáně. V rámci celé skupiny pacientů mohou být podskupiny, které lze při této sekundární analýze zohlednit.
  • Shrnutí kritérií počáteční a průběžné inspekce před/během zpracování dat:
        1. Distribuce a intenzity signálů v červeném a zeleném kanálu by měly být srovnatelné.
        2. Podíly signálů z obou kanálů by neměly vykazovat závislost na absolutní intenzitě signálu.
        3. Vysoké hodnoty podílu mezi signálem a šumem.
        4. Nepřítomnost artefaktů v hrubých obrazových datech (snímky mikroerejí ze skeneru), například po transformaci na umělé zabarvení.

 

 

        5. Vysoká míra korelace intenzity a distribuce signálu mezi technickými replikáty.
 
  • Import textových (NimbleGen .pair) souborů s extrahovaným fluorescenčním signálem do pracovního prostředí jazyka R.
  • Tvorba popisu designu experimentu.
  • Normalizace uvnitř dvoubarevné mikroreje.
  • Normalizace mezi dvoubarevnými mikroerejemi.
  • Kontrola distribuce intenzit signálu v červeném a zeleném kanálu.
 
                        Hrubá data                     Po normalizaci uvnitř         Po normalizaci mezi 
                                                           dvoubarevné mikroereje      mikroerejemi 

  • Distribuce podílů hodnot v zeleném a červeném kanálu před a po normalizaci.

Po normalizaci uvnitř dvoubarevné mikroereje        Po normalizaci mezi dvoubarevnými

                                                                         mikroerejemi 

  • Porovnání podílu intenzit signálu v kanálech a jejich absolutních hodnot– MA grafy

                     Hrubá data                    Po normalizaci uvnitř dvoubarevné mikroereje

 

  • Spárování informace o chromozómových pozicích a anotaci s normalizovaným datasetem.
  • Vynesení podílu signálů po obou krocích normalizace.

 

 

  • Průměrování technických replikátů.
  • Korelace signálů sousedících prvních a druhých nejbližších sond.
  • Vyhlazení signálů.

 

  • Segmentace a identifikace statisticky významných rozdílů.

 

Možné navazující analýzy
 
  • Průnik mezi nalezenými změnami mezi jednotlivými párovými vzorky
  • Analýza velikosti domén (boxploty).
  • Analýza procentuálních změn.
  • Klastrování vzorků.
  • Možnost alignmentu a porovnání s existujícími externími databázemi DNA elementů (například databází ENCODE).
  • Na přání zákazníka lze studiem primární i sekundární literatury nalézt, navrhnout, modifikovat a aplikovat další relevantní způsoby analýzy.

rb

 

HRM - vysokorozlišovací analýza křivek tání

Projekt je spolufinancovaný z Evropského fondu pro regionální rozvoj v rámci OP Podnikání a inovace pro konkurenceschopnost. Termín realizace: 2017-2020 Výsledkem projektu budu diagnostické testy pro vyšetření somatických mutací v krvetvorných buňkách kostní dřeně. Registrační číslo projektu:...

Kontakt

KRD - obchodní společnost s.r.o. Pekařská 12
155 00 Praha 5
Česká republika

Tel: +420 257 013 433
Mobil: +420 603 164 254
lab@krd.cz